Дополнительный материал к занятию. Критериями антимикробной активности препарата являются минимальная ингибирующая
Анализ способности бактерий размножаться и расти на средах, содержащих уменьшающуюся концентрацию лекарственного вещества, позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика (МИК), угнетающую роль бактерий in vitro ( табл. 3(vet7)). Величина этой дозы определяет выбор лекарственного вещества, способного достигнуть аналогичных значений концентрации in vivo, и является основой для сравнения относительной чувствительности организма по отношению к другим лекарственным средствам. Считается, что для обеспечения эффективности воздействия концентрация лекарственного вещества в очаге инфекции должна быть по меньшей мере равной значению минимальной ингибирующей концентрации антибиотика. С другой стороны, концентрация лекарственного вещества в плазме обычно должна быть более высокой для обеспечения адекватной его концентрации в тканях. Однако неоправданное увеличение доз противомикробных препаратов с целью достижения минимальной дозы антибиотика, угнетающей рост бактерий определенного вида in vitro, может привести к накопленйю препарата в организме реципиента в токсичных дозах.
"Критической МИК" для конкретного лекарственного вещества является наибольшая достаточно безопасная концентрация препарата, которую можно достигнуть при помощи клинически приемлемой дозы и способа применения препарата ( табл. 3(vet7)). МИК зависит от конкретного вида бактериальной культуры и конкретного вида лекарственного вещества. В тоже время критическая МИК является специфической для конкретного реципиента и конкретного лекарственного вещества. Таким образом, критическая МИК будет одинаковой для любого организма ( табл. 3(vet7)). Критическое значение концентрации для конкретного организма может отличаться в зависимости от вида животного (из-за различий в чувствительности или в характере распределения лекарственного средства) и конкретной лаборатории. Необходимо обратиться в лабораторию, предоставляющую данные относительно методов культивирования и чувствительности к антибиотикам, с целью получения критических значений, используемых в ходе проводимых там исследований.
На основании данных о разведении в пробирке бактерии относят к чувствительным (S) к конкретному лекарственному веществу, если МИК значительно ниже критического значения этого показателя. Рост патогенных микроорганизмов со средним (MS) или промежуточным (IS) значением чувствительности угнетается при концентрации препарата, приближающейся к критическому значению МИК. Такие бактерии могут вызывать отрицательные реакции организма пациента или никак не воздействовать на него. МИК для резистентных (R) бактерий превышает критическое значение минимальной дозы. Эффективное значение концентрации в организме пациента такого препарата, воздействующего на определенный микроорганизм, вряд ли будет достигнуто. В таких случаях опасность кумуляции лекарственного вещества в токсических дозах может также перевесить потенциальную выгоду от применения терапии. Критическое значение минимальной дозы антибиотиков нового поколения, угнетающих рост бактерий, в некоторых случаях труднее определить в связи с переходом на профессиональную гибкую маркировку диапазонов дозировки.
Лекарственные вещества необходимо выбирать таким образом, чтобы при их применении в соответствии со схемой, препятствующей накоплению вещества в токсических дозах, можно было достигнуть предельной концентрации лекарственного вещества в плазме, существенно превышающей МИК. Многие бактерии будут чувствительны к воздействию определенного лекарственного вещества при концентрациях намного ниже критического значения минимальной дозы. Разницу между критическим значением и собственным значением МИК можно использовать для сравнения относительной эффективности различных антимикробных препаратов. Например, для амикацина критическое значение составляет 32 мкг/мл, поэтому Е. coli со значением МИК 2 мкг/мл имеет относительно большую чувствительность к амикацину, чем Е. coli со значением МИК 16 мкг/мл. Оба вида должны считаться чувствительными (хотя второй вид можно рассматривать как имеющий среднюю чувствительность), однако рост бактерий первого вида, по-видимому, угнетается в большей степени. Если тот же самый вид Е. coli со значением МИК 2 мкг/мл по отношению к амоксицилину имеет значение МИК 16 мкг/мл (при критическом значении 32 мкг/мл), то, по-видимому, росту этого микроорганизма будет легче воспрепятствовать путем применения амикацина, а не амоксицилина , посколь ку значение МИК амикацина дальше отстоит от своего критического значения МИК, чем значение МИК амоксициллина.
Несмотря на то, что различия между значениями МИК для конкретного вида бактерий и конкретного лекарственного вещества (16 или 32) могут казаться достаточно большими (в особенности в контексте предельной концентрации лекарственного вещества в плазме), такое отличие соответствует только одному раствору в пробирке. Это является примером опасности переоценки данных о чувствительности. Если значение МИК определенного организма находится достаточно близко к критическому значению, то в силу возможных расхождений в интерпретации данному микроорганизму может в одной лаборатории быть присвоена степень чувствительности "S" или "MS", а в другой - "R". Такие возможные расхождения в оценке являются одной из причин, по которой следует избегать использования лекарственных веществ, в отношении которых определенный организм обладает чувствительностью "MS" (или если значение МИК близко к критическому), за исключением случаев, если концентрация лекарственного вещества в очаге инфекции может намного превышать значение МИК, определенное при анализе in vitro. Наглядным примером может быть использование лекарственных веществ, выводимых почками, для лечения инфекции мочевыводящих путей или использование лекарственных веществ, выводимых с желчью, для лечения инфекции желчных путей. Накопление определенных лекарственных веществ лейкоцитами ( фторхинолоны , макролиды) может также привести к концентрации препарата в тканях, значительной превышающей МИК (или критическое значение МИК), несмотря на более низкую концентрацию в плазме.
МИК бактерий может изменяться при последующих инфекциях, вызванных бактерией того же самого вида, а также способна изменяться в самом процессе инфекционного заболевания. Увеличение значения МИК может просто отражать различный подход к оценке результатов анализа (в особенности если различия выявляются только при разведении в пробирке), однако может также считаться следствием выработки резистентности по отношению к определенному лекарственному веществу. В таких случаях курс антимикробной терапии может быть изменен за счет использования дополнительного препарата или перехода на новый, более эффективный препарат. При полимикробных инфекциях значение МИК определенного лекарственного вещества, вероятно, будет разным для каждой инфицирующей бактерии. Считается, что легче воспрепятствовать росту бактерий с низким значением МИК по отношению к определенному лекарственному веществу, чем росту микроорганизма с более высоким значением МИК по отношению к тому же самому лекарственному веществу.
Оглавление темы "Методы определения чувствительности к антимикробным средствам. Побочные эффекты антибиотикотерапии.":Методы определения чувствительности к антимикробным средствам. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Метод серийных разведений в жидких средах.
Критериями активности того или иного препарата выступают минимальная ингибирующая концентрация (МИК ) - наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры и минимальная бактерицидная концентрация (МБК ) - наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.
Метод серийных разведений в жидких средах
Метод серийных разведений в жидких средах позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК ) и минимальную бактерицидную концентрацую (МБК ) препарата для выделенного возбудителя. Исследования можно выполнять в различных объёмах питательной среды (1-10 мл). Используют жидкие питательные среды, соответствующие пищевым потребностям возбудителя. В пробирках (обычно восьми) готовят серию двойных разведений препарата на питательной среде. Концентрацию уменьшают соответственно от 128 до 0,06 мкг/мл (базовая концентрация может варьировать в зависимости от активности препарата). Конечный объём среды в каждой пробирке составляет 1 мл. Контролем служит пробирка, содержащая чистую питательную среду. В каждую пробирку вносят по 0,05 мл физиологического раствора, содержащего 106/мл микробных клеток. Пробирки инкубируют 10-18 ч при 37 °С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока результаты учитывают по изменению оптической плотности среды визуально или нефелометрически. Также можно применять модифицированный метод, используя среду, дополненную глюкозой и индикатором. Рост микроорганизмов сопровождается изменением рН среды и, соответственно, окраски индикатора.
Критериями антимикробной активности препарата являются минимальная подавляющая концентрация (МПК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МПК – это наименьшая концентрация антибиотиков, которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий. Она выражается в мг/л или мкг/мл. МБК – это наименьшая концентрация антибиотика, которая вызывает бактерицидный эффект. Для её определения необходимо провести высев из пробирок (визуально отсутствует рост) на плотный питательный агар, не содержащий антибиотик. Этот показатель имеет большое клиническое значение. На основе метода серийных разведений созданы микрометоды, предусматривающие использование меньшего объёма питательной среды. В настоящее время для проведения такого рода исследований выпускаются многочисленные коммерческие наборы, состоящие из высушенных стабилизированных разведений антибиотиков, которые разбавляются суспензией тест-микроба. Данные наборы могут храниться в обычных условиях, вследствие чего исключается необходимость в приготовлении разведений среды и антибиотиков в лабораторных условиях. Достоинством тестов микроразведений является также то, что они включаются в автоматизированную систему.
На основании полученных данных (диаметра зоны задержки роста или величины МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные. Для разграничения этих категорий используют так называемые пограничные концентрации антибиотиков, которые не являются неизменными величинами. Они пересматриваются по мере изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты, микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (N ational C ommittee for C linical L aboratory S tandards – NCCLS), организованный в США. В настоящее время стандарты NCCLS используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная подавляющая концентрация (МПК) или минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибиотика, задерживающая рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта.
Для определения лекарственной устойчивости используют суточную чистую культуру возбудителя, выделенную из организма больного, и стандартную питательную среду (АГВ или Мюллер-Хинтон агар) для её посева.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят диско-диффузионным методом или методом серийных разведений антибиотика в жидких или плотных средах.
Диско-диффузионный метод
Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. Эта концентрация соответствует средней терапевтической дозе для стандартных штаммов микроорганизмов.
Приготовленную взвесь микроорганизмов засевают на поверхность специальной среды (АГВ или агар Мюллер-Хинтона) в чашки Петри. Затем стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков (также можно использовать специальные устройства и диспенсеры). Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг диска образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам, в которых указаны диаметры зон задержки роста стандартных культур, чувствительных, устойчивых и умеренно-устойчивых.
Метод дисков не даёт надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксину, ристомицину). Также этот метод не позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию антибиотика.
(МИК) - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация - наименьшая концентрация антибиотика,которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в бульонных или на агаровых питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта и выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл.
Минимальная бактерицидная концентрация (МБК)- наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени.
Чувствительный микроорганизм - штамм микроорганизма, который не имеет механизмов резистентности к данному препарату. Его его на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе.
Умеренно-резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в высшей дозе. Лечение инфекций, вызываемых умеренно-резистентными микроорганизмами, проводится при отсутствии альтернативных препаратов, высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика.
Резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, который имеет механизмы резистентности к данному препарату. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные действия антибиотика.
Показания к определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам:
1) определение чувствительности к новому антибиотику, рекомендуемому к применению;
2) периодический мониторинг антибиотикорезистентности в отдельных медицинских центрах и в различных географических регионах с целью наблюдения за распространием антибиотикорезистентности;
3) обоснование адекватной антибиотикотерапии у отдельных больных в случаях:
а) выделения микроорганизмов из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека;
б) при выделении микроорганизмов из первично нестерильных биотопов, оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма;
в) инфекций, резистентных к препаратам эмпирической терапии;
г) уникальных инфекций и отсутствии опыта их терапии;
д) инфекций, требующих пролонгированной терапии (каждую неделю терапии проводят детекцию антибиотикорезистености, так как возможна смена возбудителей).
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам нецелесообразно:
1) для представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания;
2) для видов микроорганизмов, у которых не описано резистентных форм к тем или иным антибиотикам. Например, Streptococcus pyogenes чувствительны к пенициллину, поэтому проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.
В принципе эта процедура сходна с определением МПК в жидкой "Среде. Готовят несколько чашек Петри со ступенчатыми разведениями антибиотика, растворенного в дайной среде. Добавляют расплавленный агар, чашки охлаждают, чтобы агар затвердел. На поверхности среды штрихом засевают культуры одной или нескольких бактерий и после инкубации в термостате в течение необходимого времени определяют минимальную концентрацию антибиотика, при которой подавляется рост бактерий. Одним из преимуществ этого метода перед методом титрования в жидкой среде является то, что разные участки одной и той же чашки можно засевать разными видами или штаммами бактерий. В результате величины МПК для нескольких бактерий можно определить в одном опыте (рис. 2.2).
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
Этот метод применяется для определения концентрации антибиотика в растворе. Он состоит в следующем. Диски из фильтровальной бумаги, смоченные исследуемым раствором антибиотика, помещают на поверхность агаризованной среды, содержащей разведенную суспензию бактерий. После соответствующей инкубации поверхность агара, которая вначале была полупрозрачной, мутнеет из-за рассеяния света выросшими бактериями. Полупрозрачные зоны остаются лишь вокруг дисков фильтровальной бумаги, поскольку антибиотик диффундирует в агар и подавляет рост бактерий. Если диаметр этих зон определять при строго стандартных условиях, то он будет функцией логарифма концентрации антибиотика. Используя известные концентрации антибиотика, строят стандартную кривую, по которой можно определить концентрацию антибиотика в неизвестных растворах (рис. 2.3). Иногда вместо дисков из фильтровальной бумаги используют небольшие полые цилиндрики, поставленные на поверхность агаровой среды и содержащие раствор антибиотика.
- ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Активность антибиотиков in vitro зависит от условий определения (табл. 2.1). На определение активности влияют такие факторы, как состав среды, плотность инокулума, количество бактериальных клеток в иноку луме (величина инокулума).
/
Таблица 2.1. Факторы, влияющие на определение активности антибиотиков
Тест-организм
Состав среды (pH, ионы, сыворотка, антагонисты)
Величина и плотность инокулума (гетерогенность популяции, механизмы инактивации, попадание веществ-антагонистов)
Условия инкубации (время, температура, аэрация)
А. СОСТАВ СРЕДЫ
Рассмотрим в качестве примера антибиотик, подавляющий биосинтез одной из аминокислот. Если антибиотик испытывают в среде без этой аминокислоты, то кажется, что он обладает очень высокой активностью, другими словами, имеет низкую величину МПК. При испытании в "среде, содержащей аминокислоту, синтез которой он подавляет и которую бактерия может получать из среды, антибиотик будет казаться неактивным.
Помимо таких специфических эффектов часто наблюдается менее специфическое влияние среды, не связанное непосредственно с механизмом действия или с химической структурой антибиотика. Одним особенно интересным случаем является наличие в среде сыворотки. Ее вводят в среду при определении МПК, чтобы создать физиологические условия, напоминающие условия в крови. Многие антибиотики связываются с белками сыворотки крови (в особенности с альбумином), в результате число свободных молекул антибиотика, которые могут проникать в бактериальные клетки, снижается. Связывание антибиотика с белками сыворотки обычно коррелирует с липофильностью некоторых заместителей в его молекуле.
Очевидно, что условия определения МПК в жидкой среде отличаются от условий в плотной среде хотя бы потому, что в плотной среде присутствует агар. Агар, содержащий S03-rpyn- пы, может адсорбировать антибиотик, изменяя его диффундирующую способность, или адсорбировать растворенный кислород и некоторые компоненты питательной среды. Неудивительно поэтому, что величина МПК антибиотика в отношении данной бактерии зависит от того, определена ли она в жидкой или в плотной среде, даже если эти две среды, за исключением наличия или отсутствия агара, идентичны по составу. Нужно также помнить, что физиология клеток может различаться в зависимости от того, растут ли они поодиночке в жидкости или в виде колоний на поверхности плотной среды.
Очень сильное влияние на активность антибиотиков оказывает величина pH среды. Помимо второстепенных эффектов, как то влияние pH на скорость роста микроорганизмов и, следова-
тешыно, косвенное влияние на их восприимчивость, величина pH оказывает очень сильное и непосредственное действие на способность препарата проникать,в бактериальную клетку. Например, вещества в неионизированной форме лучше диффундируют через клеточную стейку и плазматическую мембрану, чем вещества в ионизированной форме. Таким образом, pH среды, определяя степень ионизации основного или.кислого антибиотика, может прямо влиять на скорость его проникновения в бактерии и, следовательно, на эффективность.
Б. ПЛОТНОСТЬ И ВЕЛИЧИНА БАКТЕРИАЛЬНОГО ИНОКУЛУМА
Плотность инокулума - это число засеваемых бактерий, отнесенное к объему, в котором они растут. Ее обычно выражают как число клеток в 1 мл культуры. Величина инокулума - общее число засеянных бактерий. На МПК многих антибиотиков не влияют вариации в плотности обычно используемого инокулума (103-106 бактерия/мл). Действительно, даже при очень низких концентрациях антибиотика, например 0,01 мкг/мл, отношение числа молекул антибиотика к числу бактериальных клеток остается очень большим (при концентрации антибиотика с мол. массой 1000, равной 0,01 мкг/мл, в 1 мл раствора содержится ~1012 молекул). Однако имеются некоторые исключения. Например, зачастую очень много молекул антибиотика адсорбируется на наружной поверхности бактериальной клетки. Если плотность бактерий высока, число свободных молекул антибиотика, которые могут проникнуть в клетку, очень сильно снижается. Кроме того, для подавления роста одной клетки часто бывает необходимо большое количество молекул антибиотика. По мере роста бактерии синтезируют и выделяют в среду ферменты, которые могут разрушать антибиотик (например, р-лакта- мазы, действующие на р-лактамные антибиотики; см. гл. 4). Количество разрушенного антибиотика является функцией концентрации фермента в питательной среде и, следовательно, зависит от величины инокулума.
На первый взгляд кажется, что, если плотность культуры бактерий одинакова, не важно, исследуется ли активность антибиотика в маленьких объемах, например 0,25 мл и меньше в миниатюризованных системах, или в объеме 10 мл в обычных лабораторных пробирках. Если все бактерии в популяции идентичны, никакой разницы в результатах не будет.
Когда общее число бактерий в инокулуме очень велико, повышается вероятность того, что в среде будут присутствовать клетки, менее восприимчивые к антибиотику. Рост всех восприимчивых клеток будет подавлен, однако менее восприимчивые (в принципе это может быть даже единственная клетка) будут размножаться, и после инкубации в течение 18 ч образуется по-
Таблица 2.2. Факторы, влияющие на активность некоторых антибиотиков
пуляция бактерий с высокой плотностью. Значительная вариабельность величины МПК с изменением числа инокулирован- ных клеток обычно свидетельствует о высокой частоте мутантов, устойчивых к антибиотику (гл. 4). Частота появления устойчивых мутантов неодинакова для разных антибиотиков. В случае антибиотиков, используемых в клинике, она колеблется от 10~7 до 10-10.
В этом разделе описаны далеко не все факторы, которые могут влиять на активность антибиотика в отношении определенной бактерии (табл. 2.2). Поэтому, чтобы использовать подавление роста бактерий для количественного определения активности антибиотиков и получить данные, которые можно воспроизвести в разных лабораториях, необходимо, чтобы все условия были точно определены и по возможности стандартизованы.