Реакция преципитации быстрота получения результатов. Постановка реакции преципитации в геле

В реакции преципитации происходит выпадение в оса­док специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом . От реак­ции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для опреде­ления антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для опреде­ления видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установле­нии фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольше­му разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разве­дении 1:5 -1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципита­ции, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторож­но наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Про­бирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсут­ствие полосы свидетельствует о несоответствии компонен­тов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изу­чении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздей­ствием антител при обязательном участии комплемен­та. Для реакции необходимы:

1. Антиген -микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содер­жит антитела, участвуюищие в лизисе бактерий; гемолити­ческая- гемолизины, способствующие лизису эритроци­тов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, кле­ток- итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыво­ротке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от несколь­ких животных) обычно используют в качестве комплемен­та.

4. Изотонический раствор .

ПРЕЦИПИТАЦИЯ (лат. praecipitatio стремительное падение) - иммунологическая реакция осаждения из раствора комплекса антиген-антитело, образующегося в результате соединения растворимого антигена (преципитиногена) со специфическими антителами (преципитинами).

Реакцию П. широко используют для идентификации и количественного определения самых разнообразных антигенов и антител (см. Иммунодиагностика), при серодиагностике инф. болезней (см. Серологические исследования), для обнаружения примесей в пищевых продуктах, при изучении эволюционных взаимосвязей в животном и растительном мире, при исследовании структуры различных биол, соединений, в судебной медицине для определения видовой принадлежности пятен крови и других биол, жидкостей.

П. открыта в 1897 т. Краусом (R. Kraus), наблюдавшим выпадение осадка (преципитата) при смешивании бесклеточных прозрачных фильтратов бульонных культур бактерий чумы, холеры, тифа с гомологичными иммунными сыворотками. В 1899 г. Ф. Я. Чистович, иммунизируя кроликов сывороткой угря, получил преципитирующие антитела и тем самым впервые продемонстрировал видовую специфичность белков сыворотки крови. Применение П. в суд.-мед. экспертизе для определения видовой принадлежности крови было предложено в 1901 г. П. Уленгутом. Реакция получила название реакции Чистовича - Уленгута. Впоследствии было показано, что преципитирующие антитела (см.) образуются у представителей различных видов позвоночных к любым чужеродным высокомолекулярным веществам (см. Антигены ). Преципитирующие антитела принадлежат к иммуноглобулинам класов G и M (см. Иммуноглобулины). Скорость и интенсивность биосинтеза преципитирующих антител определяются рядом факторов: дозой и путем введения антигена, схемой иммунизации, особенностями хим. структуры антигена и генетическими особенностями иммунизируемого организма.

Для получения преципитирующих сывороток используют различные схемы иммунизации. Хорошие результаты дают схемы из нескольких циклов иммунизации, каждый из которых включает несколько внутривенных или внутримышечных инъекций антигена в возрастающих количествах. В 1915 г. М. И. Райский предложил схему, состоящую из первичной иммунизации и отдаленной реиммунизации. На этом принципе основано получение преципитирующих сывороток высокого титра. Первичную иммунизацию принято проводить антигеном в смеси с каким-либо депонирующим веществом (ланолином, минеральным маслом, алюмокалиевыми квасцами и др.), усиливающим иммунный ответ, а отдаленную реиммунизацию - только антигеном. Широко применяют в качестве депонирующего вещества адъювант (усилитель) Фрейнда, состоящий из смеси минеральных масел и убитых микобактерий туберкулеза (см. Адъюванты).

Раствор антигена, эмульгированный в равном объеме адъюванта Фрейнда, вводят экспериментальным животным подкожно или внутримышечно в несколько точек спины либо в подушечки задних лапок или в подколенные лимф. узлы задних конечностей. В некоторых схемах используют комбинации перечисленных способов введения. Через месяц животным вводят р-р антигена внутривенно или внутримышечно. При необходимости перед реиммунизацией проводят гипосенсибилизацию по Безредке (см. Безредки методы). При незначительном расходе антигена (1-3 мг для белковых антигенов на курс иммунизации) количество образующихся антител достигает нескольких миллиграммов в 1 мл иммунной сыворотки.

Для реакции преципитации характерна высокая специфичность. В серии работ К. Ландштейнера с антисыворотками к конъюгированным антигенам, в качестве детерминантных групп которых выступали различные органические радикалы, было продемонстрировано, что в реакции П. можно дифференцировать стереоизомеры органических соединений. Сила наблюдающихся перекрестных реакций определяется близостью хим. структуры детерминантных групп иммуноантигенов и тест-антигенов. В состав преципитата входят антигены и специфичные к ним антитела и практически не включаются другие белки сыворотки крови, кроме комплемента.

П.- высокочувствительная реакция. С ее помощью могут быть обнаружены десятые доли микрограмма антигена. При определении антител порог чувствительности реакции составляет ок. 20 мкг белка. Чувствительность реакции значительно повышается, если применяют антигены или антитела, меченные радиоактивными изотопами (см.).

Постановка реакции

При постановке реакции преципитации необходимо учитывать ее зональный характер, который выражается в том, что молекулярный состав и количество образующегося преципитата определяются соотношением введенных в реакцию антигена и антител (см. Антиген - антитело реакция). При использовании постоянного количества антисыворотки и возрастающих количеств антигена количество преципитата в ряду пробирок вначале увеличивается, достигает максимума, а затем уменьшается вплоть до полного исчезновения. В надосадочной жидкости первых пробирок обнаруживают свободные антитела (зона избытка антител), в жидкости над максимальным преципитатом не содержатся ни свободные антитела, ни свободный антиген (зона эквивалентности), в надосадочной жидкости последних пробирок находят растворимые иммунные комплексы и свободный антиген (зона избытка антигена). Образование растворимых иммунных комплексов с небольшим молекулярным весом в зоне избытка антигена характерно для всех преципитирующих систем, антитела в которых принадлежат к IgG. Эта зона реакции названа поэтому зоной задержки, или постзоной. Следует отметить, что иммунные комплексы антигенов с IgM-антителами нерастворимы в очень большом избытке антигена, в десятки раз превышающем его количество, достаточное для образования растворимых иммунных комплексов с IgG-антителами.

Для лошадиных противобелковых сывороток характерно образование растворимых иммунных комплексов и в зоне избытка антител, т. е. образование прозоны (см. Нейссера-Вексберга феномен). Эту особенность реакции впервые обнаружил Г. Рамон в системе дифтерийный токсин - антитоксическая лошадиная сыворотка (см. Флоккуляция). Растворение иммунных комплексов в зоне избытка антител наблюдали впоследствии при проведении П. с кроличьими и собачьими сыворотками крови против бычьего сывороточного альбумина, с человеческой сывороткой крови против тиреоглобулина, овечьей антисывороткой против синтетических полипептидов.

Молекулярный состав преципитата определяется также мол. весом (массой) антигена. Для яичного альбумина, мол. вес к-рого 42 000 дальтон, в зоне эквивалентности на одну молекулу антигена приходится в среднем 2,5 молекулы антител. С увеличением мол. веса антигена число молекул антител, связываемых одной молекулой антигена, увеличивается.

П. используют для качественного и количественного определения антигенов и антител. Быстрый, простой и чувствительный качественный метод П.- кольцепреципитация, предложенная в 1902 г. Асколи. Кольцепреципитацию применяют для идентификации растворимых антигенов микроорганизмов. Реакцию выполняют в узких пробирках или капиллярах, осторожно наслаивая р-р антигена на иммунную сыворотку. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется кольцо преципитации. На результат реакции не влияет избыток антигена благодаря постепенной диффузии реагентов к границе жидкостей. Если в качестве антигенов используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то реакция носит название «термопреципитация» (см. Асколи реакция). С помощью термопреципитации обнаруживают термостабильные бактериальные антигены (коктоантигены) в тканях и органах погибших животных при диагностике чумы, холеры, сибирской язвы. Кольцепреципитацию и термопреципитацию выполняют с антисыворотками высокого титра.

К полуколичественным методам П. могут быть отнесены методы оценки силы сывороток и количества антигенов по их предельному разведению, дающему еще видимую П. со стандартным антигеном или анти-сывороткой, и методы оптимальных пропорций.

При титровании сывороток по предельному разведению необходимо подбирать такое количество антигена, чтобы не попасть в зону задержки. Поэтому предварительно определяют наименьшее разведение тест-антигена, при к-ром происходит реакция с заведомо положительной сывороткой. Это рабочее разведение (дозу) антигена используют для определения предельного разведения (титра) испытуемых сывороток. Сравнительное титрование антигена методом предельных разведений можно проводить без предварительного подбора рабочей дозы сыворотки, если она содержит антитела преципитирующего, но не флоккулирующего типа.

Метод оптимальных пропорций основан на определении точки эквивалентности серол. системы по инициальной И. и на том наблюдении, что точка эквивалентности в каждой серол. системе возникает при определенном отношении антитела к антигену. Поэтому при титровании сывороток, определив по быстроте П. количество стандартного антигена, соответствующее точке эквивалентности, можно выразить ее активность в любых условных биол. единицах, если в предварительном титровании с сывороткой известной силы установлено, скольким ее единицам эквивалентен стандартный антиген. Аналогичные расчеты проводят при титровании антигена со стандартной сывороткой. Метод оптимальных пропорций может быть выполнен в a-варианте, предложенном Дином и Уэббом (H. Dean, R. Webb, 1928),- с постоянным объемом сыворотки и возрастающими разведениями антигена и в ß-варианте, предложенном Г. Рамоном (1922),- с постоянным объемом антигена и возрастающими разведениями сыворотки.

Количественный метод определения антител в весовых единицах, предложенный в 1933 г. Гейдельбергером (М. Heidelberger) и Кендаллом (F. Е. Kendall), основан на том, что в зоне эквивалентности из раствора в осадок выпадают практически весь антиген и все антитела. Определив любым хим. методом количество белка преципитата в этой точке и вычтя из него количество прибавленного в пробу антигена, рассчитывают количество белка в осадке, приходящееся на долю антител.

При постановке П. любым из описанных методов следует работать с хорошо отцентрифугированными р-рами антигенов и сывороток. Реакция должна сопровождаться контролем: иммунная сыворотка + изотонический р-р хлорида натрия, нормальная сыворотка + антиген, гетерологическая сыворотка + антиген. Следует предотвращать возможность бактериального загрязнения, выполняя П. в стерильных условиях или применяя консерванты типа мертиолата, амида натрия. Реакцию выполняют при физиол. концентрации соли (0,15 М раствор хлорида натрия), в диапазоне pH 6,5-8,0.

Определение индивидуальных антигенов, находящихся в смеси с другими веществами, возможно в реакции П. только при использовании моноспецифических сывороток. Специфические антитела в сыворотках могут быть идентифицированы, если П. выполняют с индивидуальными антигенами. Для анализа, характеристики и сравнения многокомпонентных систем антиген - антитело без их предварительного фракционирования используют методы, основанные на проведении П. в геле, в частности метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню (см. Иммунодиффузия) .

П.- двухфазная реакция. Фазы реакции отличаются по механизму и скорости протекания (см. Антиген-антитело реакция). Следует учитывать, что на вторую фазу реакции - собственно образование преципитата - оказывает влияние ряд неспецифических факторов: концентрация в растворе солей и водородных ионов, температура, объем реагентов. При увеличении концентрации солей выше физиол, значения (0,15 М) количество образующегося преципитата уменьшается. В 15% р-ре хлорида натрия преципитаты, образованные полисахаридными антигенами, диссоциируют. Изменение концентрации водородных ионов в физиол. пределах pH (от 6,5 до 8,0) заметно не влияет на формирование преципитата. При снижении pH раствора до 5,0 или повышении до 9,0 существенно уменьшается количество образующегося преципитата, а при pH ниже 3,0 и выше 11,0 ранее образованные преципитаты диссоциируют. На свойстве преципитатов диссоциировать в крепких солевых р-рах и при крайних значениях pH основаны методы выделения чистых антител и антигенов из специфических преципитатов. Наиболее употребляемые диссоциирующие агенты - концентрированные р-ры нейтральных солей, разбавленные к-ты и щелочи, концентрированные р-ры амидов, полианионы.

Преципитация в судебно-медицинском отношении

В судебной медицине П. применяют для дифференцирования крови человека и животных (см. Кровь). Наибольшее распространение получила кольцепреципитация, но она не пригодна для исследования мутных р-ров антигена и подвержена неспецифическим влияниям загрязнений объекта экспертизы. Этих недостатков лишена П. в агаровом геле, однако она требует длительных сроков наблюдения и менее чувствительна. Внедряют в практику электропреципитацию, или встречный иммуноэлектрофорез (см.), сочетающий достоинства П. в агаре с высокой чувствительностью и быстротой проведения реакции. Все варианты П. осуществляют с иммунными сыворотками (см.), преципитирующими белки человека, собаки, лошади и др. Они должны быть активны и специфичны, т. е. вызывать П. гомологичного антигена (напр., соответствующей нормальной сыворотки крови человека пли животного) и не образовывать преципитата с гетерологичными (чужеродными) антигенами.

Из исследуемых пятен крови готовят вытяжки и разводят их до необходимой концентрации белка. Для П. в агаре можно брать вырезки (вытяжки) из пятен и проводить реакцию с несколькими преципитирующими сыворотками. Параллельно испытывают контрольные участки предмета - носителя пятен, которые не должны вызывать П. При положительном результате с пятном крови и преципитирующей сывороткой делают вывод о видовой принадлежности крови, напр. кровь человека, собаки и др. При этом нельзя точно установить происхождение крови, если она принадлежит близкородственным животным (напр., кровь собаки или волка). Отрицательный результат при наличии в вытяжке белка свидетельствует о принадлежности крови животному, белок к-рого не выявляется с помощью обычного набора преципитирующих сывороток. Если в вытяжке не установлен белок, то принимают во внимание лишь положительный результат, т. к. отсутствие преципитата можно объяснить недостаточным количеством белка в вытяжке.

Библиография: Бойд У. Основы иммунологии, пер. с англ., с. 314, М., 1969; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., с. 8 и др., М., 1968; Райски й М. Быстрое получение крепких преципитинов, Харьковск. мед. журн.,т. 20, № 8, с. 135, 1915; он же, Повторная иммунизация, как метод получения преципитирующих сывороток, там же, с. 142; он же, Как долго сохраняются в крови иммунизированного животного крепкие преципитины, там же, № 9, с. 161; он же, Как нужно иммунизировать, чтобы животное устойчиво и длительно сохраняло в крови крепкие преципитины, там же, с. 169; Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств^ с. 57,М., 1975; Чарный В. И. Установление видовой специфичности белков крови, М., 1976; Чистович Ф. Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки и крови, в связи с теорией иммунитета Ehrlich’a, Рус. арх. патол., клин, мед. и бакт., т. 8, в. 1, с. 21, 1899; С а г-р enter Ph. L. Immunology and serology, Philadelphia, 1975; Methods in immunology and immunochemistry, ed. by C. A. Williams a. M. W. Chase, v. 3, N. Y.- L., 1971.

И. А. Тарханова; В. И. Чарный (суд.).

Иммунодиагностические реакции. Реакции антиген-анитело и реакции с меченными компонентами. Использование в целях идентификации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изу­чения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюорес- центный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно- . ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Ниже приводятся принципы и схемы ос­новных иммунодиагностических реакций. Детальная техника постановки реакций дана в. практических руководствах по иммуноди­агностике.

Реакция агглютинации - РА (от лат. aggluti - natio - склеивание) - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр- ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка

РА используют для:

определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

определения возбудителя, выделенного от больного;

определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло- антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа- гностикумов (О- и Я-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким:^особом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглюти­нации (РНГА, РПГА) основана на использо­вании эритроцитов с адсорбированными на ■х поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови бальных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроциты оседают ■ виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представ­ляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Иногда применяют антительные эритроцитарные диагностику мы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антитель­ный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непря­мой гемагглютинации - РОНГА). РНГА при­меняют для диагностики инфекционных бо­лезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в не­которых других случаях.

Реакция коагглютинации . Клетки возбуди­теля определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc -фрагменту иммуноглобулинов, неспеци­фически адсорбируют антимикробные анти­тела, которые затем взаимодействуют актив­ными центрами с соответствующими микро­бами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состо­ящие из стафилококков, антител диагности­ческой сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении ан­тигенов вирусов антителами иммунной сы­воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики мно­гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево­го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (см. разд. 10.1.4.1) с помощью агглютина­ции эритроцитов антителами иммунной сы­воротки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, несодер- жащая антител, т. е. сыворотка AB (ГУ) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эрит­роциты группы 0 (I).

В реакции агглютинации для определения резус-фактора (см. разд. 10.1.4.1) используют антирезусные сыворотки (не менее двух раз­личных серий). При наличии на мембране ис­следуемых эритроцитов резус-антигена проис­ходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты всех групп крови.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких боль­ных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалент­ными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему анти- резусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобули­нов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов (рис. 13.4). С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состо­яния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например ге­молитическую болезнь новорожденных: эрит­роциты резус-положительного плода соединя­ются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые пере­шли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Реакции преципитации

Реакция преципитации - РП (от лат. praeci- pito - осаждать,) - это формирование и осаж­дение комплекса растворимого молекулярно­го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк­вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита­тельных средах и др. Широкое распростране­ние получили разновидности реакции преци­питации в полужидком геле агара или агаро- зы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектро- форез и др.

Реакция кольцепреципитации . Реакцию про­водят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соот­ношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 13.5). Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципи­тации вследствие постепенной диффузии ре­агентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации ис­пользуют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита- иии (реакция Асколи, при сибирской язве/

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерюни . Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стек­лянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2-3 мм. В эти лунки раздельно помещают антигены и иммун­ные сыворотки, которые диффундируют на­встречу друг другу. В месте встречи в эквивален­тных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентич­ных - пересекаются (рис. 13.6).

Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммун­ную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застыва­ния в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диф­фундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуног­лобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет­ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела кото­рой, диффундируя в гель, образуют в месте - встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. floccus - хлопья шерсти)- появление опалес- ценции или хлопьевидной массы (иммуноп- реципитации) в пробирке при реакции ток­син-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Иммунная электронная микроскопия - элек­тронная микроскопия микробов, чаще ви­русов, обработанных соответствующими ан­тителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра­зуется «венчик» из антител, контрастирован- ный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­

го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция иммунного прилипания (РИП ) ос­нована на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сыво­роткой. В результате образуется активирован­ный третий компонент комплемента (СЗЬ), который присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для СЗЬ, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими СЗЬ, происходят их соединение и агглютинация.

Реакция нейтрализации

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микро­бных антигенов антителами, т. е. их нейтрали­зацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген-антитело жи­вотным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем дейс­твии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело (рис. 13.9).

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса)

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с ком­плементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Бактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген-антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)

ИФА - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хре­на, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с ме­ченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА - наиболее распростра­ненный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках план­шеток из полистирола

При определении антител в лунки планше­ток с сорбированным антигеном последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.

Конкурентный вариант ИФА . искомый ан­тиген и меченный ферментом антиген кон­курируют друг с другом за связывание ог­раниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест - искомые антитела

и меченые антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены.

Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­дионуклидом (125 J, 14 С, 3 Н, 51 Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение):

интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител.

При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода - конкурентный РИА. ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концент­рациях - 10~ |0 -И0~ 12 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (ИБ) - высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антиген выделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. blot , пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»

антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека выявляют до­бавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).

ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.

Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.

Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.

Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.

Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.

Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.

Линии из преципитата.

Агаровый гель.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.

С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.

Реакции лизиса.

Для этого надо знать:

Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.

3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.

Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Постановка реакции гемолиза .

Для постановки реакции гемолиза необходимы:

3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;

Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);

Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.

Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.

Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.

Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.

Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.

Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.

Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.

РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Механизм

Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата - помутнение.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.